姿容组织成员,普拉多NA转录后的加工与修饰

日期:2020-04-06编辑作者:生命科学

核心提示:RNA酶,是一种将RNA水解成小分子核苷酸的核酸酶。可简单分为外切核糖核酸酶和内切核糖核酸酶。其中外切酶包括PNPase,RNase PH,RNA酶,是一种将RNA水解成小分子核苷酸的核酸酶。可简单分为外切核糖核酸酶和内切核糖核酸酶。其中外切酶包括PNPase,RNase PH,RNase Ⅱ,RNase R,RNase D,RNase T,Oligoribonuclease,Exoribonuclease I,Exoribonuclease Ⅱ 等;内切酶包括RNase A,RNase H,RNase I,RNaseⅢ,RNase L,RNase P,RNase PhyM,RNase T1,RNase T2,RNase U2,RNase V1,RNase V 等。

不论原核或真核生物的rRNAs都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的,然后再加工成为成熟的RNA分子。然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的,随着mRNA开始的DNA上合成,核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成,因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程,相反,真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的,刚转录出来的mRNA是分子很大的前体,即核内不均一RNA。hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA,其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。

mRNA的加工修饰

在成员众多的RNase家族,就有这么一个“外貌协会”成员,它就是只针对线性RNA的RNase R。在介绍RNase R之前,先允许小达君给大家科普下环状RNA~~

原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子,即几个结构基因,利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA,所以此mRNA分子编码几种不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因,转录生成的mRNA可翻译生成三种酶,即半乳糖苷酶,透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核模,所以转录与翻译是连续进行的,往往转录还未完成,翻译已经开始了,因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。

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真核生物转录生成的mRNA为单顺反子,即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。

图1. 线性RNA与环状RNA

真核生物mRNA的加工修饰,主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。

环状RNA(Circular RNA,circRNA)是区别于线性RNA的一类新型环状非编码RNA,半衰期长,具有物种保守性和组织特异性。其独特的环状结构使其不容易被RNA酶降解,因此在细胞内稳定性很强,在新型生物标记、生物学机制研究等方向具有巨大的潜力和研究价值。

1.在5’端加帽

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成熟的真核生物mRNA,其结构的5’端都有一个m7G-PPNmN结构,该结构被称为甲基鸟苷的帽子。如图17-9所示。鸟苷通过5’-5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN时,此时形成的帽子被称为“帽0”,如果附m7G-PPNmN外,这个核糖的第“2”号碳上也甲基化,形成m7G-PPNm,称为“帽1”,如果5’末端N1和N2中的两个核糖均甲基化,成为m7G-PPNmPNm2,称为“帽2”。从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出,生物进化程度越高,其帽子结构越复杂。

图2. 环状RNA的稳定性

图17-9 Post-transcriptional modification of mRNa showing the7-methylguanosine cap and poly-A tail.

“cicrRNA”这一概念最早出现在1971年,在RNA病毒中被发现,但长期以来,由于其表达丰度很低,所以一直被认为是转录的“噪音”,没有实际作用。

真核生物mRNA 5’端帽子结构的重要性在于它是mRNa 做为翻译起始的必要的结构,对核糖体对mRNA的识别提供了信号,这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性,保护mRNa 免遭5’外切核酸酶的攻击。

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2.在3’端加尾

图3. 环状RNA的miRNA海绵作用

大多数的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴的拼接

直到2012年,Salzman的一篇环状RNA文章为其正名,于是大量的研究者涌入这个领域,不断产出环状RNA的研究成果。目前研究最多的就是位于细胞质中的外显子形成的环状RNA,其含有大量miRNA结合位点,可起到miRNA海绵作用,结合并封闭miRNA的调控作用,从而使其靶基因表达增强。

原核生物的结构基因是连续编码序列,而真核生物基因往往是断裂基因,即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开,一个真核生物结构基因中内含子的数量,往往与这个基因的大小有关,例如胰岛素是一个很小的蛋白质,它结构基因只有两个内含子,而有些很大的蛋白质,它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后,切去内元,将有编码意义的核苷酸片段连接起来。

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图17-10 Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing(a)introns after capping and addition of polyA tail.(b)Excision of introns toform the mature mRNA is called splicing.

图4. RNase R分离套索RNA

真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子,也含有无表达活性的内含子,但内含子序列下是无意义的,越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控,在转录时,外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中hnRNA进行剪接作用,首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子;然后在连接酶作用下,将外显子各部分连接起来,而变为成熟的mRNA,这就是剪接作用,也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用,例如α-干扰素基因,图17-11以卵清蛋白基因为例,介绍一个典型的转录及加工过程。

随着环状RNA的深入研究,环状RNA制备问题就越来越备受关注。Lucigen提供大肠杆菌来源的RNase R,是一种Mg依赖性的3’→5’核糖核酸外切酶,能消化基本上所有线性RNA,但不消化套索或环状RNA的结构,或者3’突出短于7个核苷酸的双链RNA。即是除了tRNA,5S RNA和内含子套索结构外,大多数细胞RNA都将被RNase R完全消化。如图4,RNase R可从总RNA中分离出内含子前体mRNA剪切产生的套索RNA。以这种方法获得的RNA作为模板来生产标记的cDNA,可作为含有潜在的内含子序列的微阵列的目标,或者用于包含完整的染色体或者基因组的重叠区域平铺阵列。产生的cDNA不代表线性内含子,但其含有的序列是来源于内含子的。

图17-11 卵清蛋白基因转录及加工过程

应用

图中外显示以1、2、3、4……表示,内含子以A、B、C、D…表示

1.选择性剪切研究

mRNA的拼接,需要在拼接部位有供拼接识别的保守性强的一致顺序,通过对100多种真核细胞基因的分析,发现外元和内元拼接部位部分碱基顺序有一定的规律。

2.基因表达研究

表17-4 含有内元的转录产物其拼接处的碱基顺序

3.内含子cDNA制备

基因区域ExonIntronExon卵清蛋白内元2UAAG GUGA~~~~~~~ACAGGUUG卵清蛋白内元3UCAG GUAC~~~~~~~UCAGUCUGβ-珠蛋白内元1GCAG GUUG~~~~~~~UCAGGCUGβ-珠蛋白内元2CAGG GUGA~~~~~~~ACAGUCUCIgλ内含子1UCAG GUCA~~~~~~~GCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAG GUAA~~~~~~~UUAGAUUC

4.cDNA文库内含子筛选

表中划线的碱基对拼接识别有重要作用,如将兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT改为AT后,拼接反应即受到影响。

5.剪切中间体和套索RNA分离

mRNA前体拼机制

产品信息

图17-12 The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by aspliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as greencircles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide inthe intron sequence,which is located colse to the 3'splice site ,attacks the5'splice site and cleaves it;the cut 5'end of the intron sequence therebybecomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotideshown in Figure 8-55.In step 2 the 3'-OH end of the first exon sequence,whichwas created in the first step,adds to the beginning of the second exonsequence,cleqving the RNA molecule at the 3'splice site;the two exon sequencesare thereby joined to each other and the intron sequence is released ad aribosone.These splicing reactions occur im the nucleus and gengerate mRNamolecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor molecules).

产品

名称

货号

规格

厂家

RNase R

RNR07250

250U

Lucigen

mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA参与它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒,SnRNA分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由与内元右端拼接部位附近的UACUAA顺序高度互补,形成一个环状结构,由特定的酶来识别切除该环状结构,完成拼接过程,如图17-12所示。

图17-13 Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shownin two stages;energy is not required for the process since transesterificationreactions are involved.

真核生物 mRNA前体在剪接过程中,还可以形成套索样的结构,在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基,它的2’-OH可以自动攻击内含子5’端与外显子1连接的磷酸二酯键,切开了外噗子1,而腺苷酸原来已有3’,5’--磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基,加上此3’,5’-磷酸二酯键连接后,在腺苷酸处出现了一个套索,已被切下的外显子1的3’-OH攻击内含子3’末端与外显子2之间的3’,5’-磷酸二酯键,键断裂后,内含子以套索的形式被节下来,此时外显子1和外显子2可以连接起来。

不论拼接过程如何,拼接必须极为精确,否则会导致遗传信息传递障碍,合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是β-地中海贫血的高发区,这是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序,结果造成错误部位的拼接。加工成熟的mRNA虽能翻译,但产物不是正常的β-珠蛋白,结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。

rRNA转录后加工

原核生物rRNA转录后加工,包括以下几方面:①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子;②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰;③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基

图17-14 大肠杆菌rRNA前体的加工

真核生物rRNA前体比原核生物大,哺乳动物的初级转录产物为45s,低等真核生物的rRNA前体为38s,真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。

图17-16 四膜虫rRNA前体的自我剪接

这种rRNA的自身剪接反应给人们一个提示:即RNA分子也有酶的催化活性。这向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分别发现RNA具有催化作用,他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。很可能在原始生命中,RNA所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。为此,他们共同获得了1989年Nobel化学奖。

从大多数Ribozymw的结构中发现一些特征,例如:锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列,如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片,科学家们在体外没计并人工合成这种RNA分子,用于抗肿瘤及抗病毒的实验中。

图17-17 锤头结构模式图

tRNA转录后的加工修饰

原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性,需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’-OH连接-ACC结构。

图17-18 tRNA前体的加工

①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下,切成一定在小的tRNA分子。大肠杆菌RNase P可特异剪切tRNA前体的5’旁顺序,因此,该酶被称为tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外,tRNA前体的剪切尚需要一个3’-核酸内切酶,这可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切下来。此外RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子,它是由RNA和蛋白质组成,最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下,可以单独地催化tRNA前体的加工成熟,这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下,将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。

②成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基,因此tRNA在甲基转移酶催化下,某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸

③3’末端加上CCA:在核苷酸转移酶作用下,3’--末端除去个别碱基后,换上tRNA分子统一的CCA-OH末端,完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。

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