细胞培养入门教程,细胞房工作守则

日期:2020-02-15编辑作者:生命科学

核心提示:一、常规操作1.穿着专用实验服。自己的白大衣或厚外套,可脱在门外的衣帽架上。2.穿着专用一、常规操作1.穿着专用实验服。自己的白大衣或厚外套,可脱在门外的衣帽架上。2.穿着专用拖鞋。在缓冲间换下自己的鞋子,尽量避免在缓冲间走动、停留。3.细胞房最多可4个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈。二、培养箱使用规则1.从培养箱取放物品前,用酒精清洁双手,尽量缩短开门时间和减少开门次数。*培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱,容易造成污染。2.培养瓶皿放入培养箱前,用酒精消毒表面,并稍等至酒精挥发后再放入,以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。3.2-3人共用一层培养箱,按预定位置摆放培养器皿,方便查找,以免长时间敞开培养箱。4.普通培养中的细胞,若非实验需要,每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次,2人以上共用的细胞,可约好时间一起观察。*频繁将细胞拿出观察,容易给培养箱造成污染,同时也会影响细胞生长条件的恒定。三、显微镜使用规则1.显微镜使用前,用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。2.离开细胞房时或较长时间不需使用时,及时关上电源,延长灯泡寿命。尽量避免频繁开关显微镜电源。四、超净台相关操作规则1.超净台使用遵循预约原则。无预约者若有必要在他人预约时段内使用,需先征得预约者的同意,否则应无条件让出工作台,以免耽误他人实验。2.超净台使用前用紫外灯照射15分钟灭菌,使用前、后需用酒精棉球擦拭工作区消毒,所有物品放入超净台内使用前均应消毒。3.点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够,液面应占瓶高1/3-2/3。*消毒用75%的酒精,酒精灯用95%的酒精,向喷壶或灯内添加酒精时请留意。*酒精和酒精棉球由值日生负责补给,发现细胞房内存放量不足时请及时通知值日生。4.超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只,用于暂时存放废弃物,实验结束后将杯内垃圾倒入水池或垃圾桶中,并冲洗晾干备用。*将废弃的枪头、管子内的残留液体打入废液杯后再弃入废品杯中,以免垃圾桶内留有大量培养液滋生细菌。5.可回收的移液管、离心管、培养瓶皿等,放入装有清水的塑料桶中浸泡,桶内需有足量的清水以没过浸泡物品。*可回收器皿必要时先初步涮洗后再放入桶内,尤其是培养瓶或血清管中有大量高营养的液体残留时,容易使桶内的清水长菌。*保证浸泡的瓶、管内完全被清水充满,而不是在装有大量空气的情况下被压倒桶底。*塑料桶内物品由值日生每天负责送去清洗,使用者实验结束后若发现桶已装满,请通知值日生或顺手将塑料桶带出细胞房。6.装培养液的瓶子、配培养液的器皿勿放入塑料桶内浸泡!应由使用者本人及时清洗晾干备用。*因桶内物品通常要浸泡几小时以上才送去清洗,此时细菌可能已在桶中生长并释放内毒素。细菌内毒素很难通过常规湿热灭菌步骤去除干净,即使干烤也不能保证其完全失活。内毒素对细胞生长及多种实验均有较大影响。*洗涤程序:洗洁精洗净,清水冲十次以上去除洗涤剂残留,然后冲去离子水3次,再用双蒸水1次,倒置于器皿柜中晾干。关上器皿柜的门防尘。五、培养液、试剂等相关操作规则1.从冰箱取放物品动作要迅速,关门时要检查门是否关好。按类别存放试剂。2.培养液母液是公用,由值日生负责配制,长期存放于-20℃。使用时按比例加入血清配成培养液工作液,打开使用后的母液存放于4℃,要注意避免污染。发现4℃存放的培养液量不足时及时从-20℃中预解冻,若-20℃中已没有储备,请及时通知值日生。3.分装好的血清长时间保存于-20℃,使用前放于4℃预解冻。从-20℃取用血清者需登记,并在血清管上签上使用者名字,若使用别人解冻的血清需征得同意以免耽误他人实验。按需解冻,避免反复冻融。4.原则上解冻好的血清应全部配成含血清的培养基备用,若有剩余,则暂存于4℃并尽快使用。尽量不要使用他人开过的血清,以免交叉污染。六、值日生工作职责1.每周值日生时间从周六开始,至下周五结束。2.值日周开始时需做的事情:在周六、日或之前准备好灭菌的枪头、离心管、干烤好的玻璃器皿,供未来一周的使用。配制消毒用的75%的酒精,制作酒精棉球,给细胞房内添加足够的95%乙醇供酒精灯使用。*新离心管灭菌前,先用去离子水过2-3次,再用双蒸水冲1次,烘干后用牛皮纸包好、灭菌。*75%的酒精可用750ml 95%的酒精加去离子水至950ml配制而成。3.值日周内每天需做的事情:开大紫外灯消毒细胞房15-30min;将装满浸泡物品的塑料桶拎出细胞房送洗,并将空桶放回细胞房;更换垃圾袋;检查培养箱内水量是否足够;检查灭菌物品的储备情况,以便及时补充;检查培养液母液、血清、酒精等公用试剂的储备情况。4.值日周结束前需完成的事情:星期五或前后一天内打扫细胞房。包括拖地,擦桌子、吊柜、清洁和整理抽屉,擦超净台、冰箱及桌上的仪器,给水浴锅加水或换水,洗细胞房专用的实验服和拖鞋,紫外消毒细胞房。切记给培养箱换MilliQ水,保证水质清洁!*若上周值日生及时给培养箱内水槽加足水,根据经验未来一周内培养箱不会干水,但值日生仍应经常检查,以便及时发现异常情况。5.每 2周清洁一次培养箱:先将培养箱中的物品取出暂存于超净台内,对于比较敏感的细胞可以暂存于404细胞房的培养箱;将培养箱内的不锈钢板取出,包括4块横板和左右2块立着的架子,用酒精棉球清洁钢板和培养箱内壁;打开培养箱清洁内壁时动作要迅速,避免长时间敞开门使得大量不洁净空气进入,缩短过滤器的寿命;用紫外灯照射培养箱内部15min,手提紫外灯放入培养箱前要用酒精棉擦拭干净。6.配制培养液母液:培养液有RPMI1640和DMEM两种,配方见404公共配液房;配制培养基要提前干烤量筒、烧杯、250ml血清瓶,湿热灭菌滤器、血清瓶瓶盖,国产滤膜使用前用MilliQ水浸泡15min以上或过夜。七、常用溶液的配制1、RPMI 1640:干粉一包,碳酸氢钠 2.0g,Hepes 2.38g,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml,搅拌1-2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;2、DMEM:干粉一包,碳酸氢钠 3.7g,Hepes 2.38g,丙酮酸钠110mg,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml,搅拌1-2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;3、胰蛋白酶:用D-Hanks配制,浓度为0.25%, 搅拌2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;4、青霉素:80万单位/瓶,加入4ml PBS,配成浓度为200000U/ml的母液;5、链霉素:按质量体积比配制,用PBS配成浓度为200mg/ml的母液。

核心提示:常用设备准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规(放置消毒过

常用设备

准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。

培养室的设备:液氮罐、储品柜、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱、空调、二氧化碳缸瓶、边台。必须放在无菌间的设备:离心机、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。

无菌操作无菌室的灭菌:1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌:用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示:1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。

器械的清洗和消毒玻璃器械洗消:

一、新的玻璃器皿的洗消:1.自来水刷洗,除去灰尘。2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸包装。6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消:1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液,12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压消毒,再烘干备用。

橡胶和塑料:橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时,自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。4. 胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2―3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000―100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时__这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。

注意事项:1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。

细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤:

一. 水的制备:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

二.PBS的制备与消毒:1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4・H2O 1.56g,KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

四.青、链霉素溶液的配制于消毒1. 所用纯净水需要15磅高压20分钟灭菌。2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克?

五.RPMI1640的制备与消毒:1.溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次,充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

六.血清的灭火:细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。

七.HEPES溶液:HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺:合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制:含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为℃。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。

十. Ⅰ型胶原酶:0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明胶溶液:因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)―即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中, 4℃保存。其他培养用液的配制:20ug/ml内皮生长因子,注意事项:1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。

细胞传代培养

具体操作:

一. 传代前准备:1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

二.胰蛋白酶消化;1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗,加入适量消化液,注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。

三.吹打分散细胞:1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四.分装稀释细胞:1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

五.继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。传代细胞培养注意事项:1.严格的无菌操作2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。

细胞的复苏细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

具体操作

一. 实验前准备:1.将水浴锅预热至37℃2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二.取出冻存管:1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

三.迅速解冻:1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

四.平衡离心:用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min

五.制备细胞悬液:1.吸弃上清液。2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。

六.细胞计数:细胞浓度以5×105/ml为宜。

七.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误:1水浴锅未预热或者未预热到37℃。2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。

细胞计数实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作:

一.准备工作:取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。

二.细胞悬液制备:细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。

三.细胞计数:1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:/ml= ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.细胞计数要点:1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

五.初学者易犯的错误:1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。

六.本实验特殊试剂的配制:4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。使用液:使用时,用PBS稀释母液至0.4%即可。细胞的冻存1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。4.置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

注意事项:1.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最好戴上手套操作。2.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。3.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。

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