细胞凋亡的研究方法,几种细胞凋亡的检测方法

日期:2020-02-15编辑作者:生命科学

核心提示:一、形态学研究方法 (Morphological methods): 1、普通显微镜 : 凋亡细胞变小、变形、细胞膜完整、发泡现象,晚期可见凋亡小一、形态学研究方法 (Morphological methods): 1、普通显微镜 : 凋亡细胞变小、变形、细胞膜完整、发泡现象,晚期可见凋亡小体。 Giemsa 核染料:染色质浓缩、凋亡小体。 2、电子显微镜:细胞质浓缩、核变小、晚期核碎片成凋亡小体。 3、操作步骤 (Morphological methods): 普通显微镜:将培养有细胞的24孔培养板于倒置显微镜下观察,观察经过诱导、和未诱导组的细胞形态、大小和细胞凋亡小体,照相记录。 电子显微镜:5x106 细胞,加25%戊二醛固定,再用1%哦酸固定,将细胞置于丙酮:包埋基中2小时,切片,透射电镜观察。可见细胞膜完整,核变小,染色质浓缩并结块/沿核膜内侧排列,晚期核裂解为碎片产生凋亡小体。 二、生物化学研究方法: 1、原理:染色质核小体单位 断裂 50~300kb,或180~200 bp整倍数片段(DNA ladder)。 2、设备:离心机、Agarose电泳装置,X-底片,照相系统 3、步骤: 5 x 106 细胞,加裂解液,离心,酚 / 氯仿提取细胞DNA,Agarose电泳,EB染色,拍照。 细胞量很少时,可用32P-ATP加脱氧核糖核苷酸末端转移酶标记DNA,电泳、放射自显影,观察DNAladder。 三、分子生物学研究方法: 1、TdT介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucletidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL): 原理:染色质核小体单位断裂50~300kb,30%酶切成180~200bp片段,3’-OH缺口可在TdT作用下将标记有荧光素、生物素、过氧化酶等的核苷标记到3’-末端。正常细胞DNA很少断裂,很少被染色。 2、荧光素标记测定法: 原理:地高辛-11-dUTP在TdT作用下标记到3’-末端。荧光素标记的地高辛抗体进行检测。可在激发光494nm时产生523nm的发射光,可在荧光显微镜下计数或使用流式细胞仪进行定量。信号强度比正常细胞高28倍,比坏死细胞高10倍。 特点:1、可测定早期凋亡细胞; 2、可测定DNA发生断裂的时相; 3、地高辛/抗地高辛标记系统特异性好; 4、适用于石蜡组织切片、冰冻组织切片,培养或分离的细胞的凋亡测定。 设备:荧光显微镜/流式细胞仪,离心机,染色缸,水浴。 步骤:将5x106细胞加入1%副甲醛,固定15min,离心,加70%乙醇,-20°C保存,洗涤,加TdT2滴和50ul反应液。离心,洗涤,加100ul荧光素标记的地高辛抗体,加1ml碘化丙啶,染色15min,流式细胞仪测定。荧光素标记的地高辛抗体可产生 523nm的发射光,代表凋亡细胞;在620nm处PI产生红色荧光,代表其余全部细胞数目。 四、免疫组织化学方法: 1、原理:染色体裂解成核小体DNA,并与组蛋白H2A、H2B、H3、H4紧密结合,保护DNA。用抗组蛋白和抗DAN的抗体ELISA法,提高灵敏度并能测定早期凋亡细胞。 2、方法:抗组蛋白抗体包被酶标板,加入含有核小体的待测细胞裂解液,加入抗DNA抗体-POD(可与核小体中的DNA结合),加底物DAB,酶标仪测定。 3、设备:试剂盒(BoehringerMannheim),酶标仪,酶标板。

核心提示:一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。2、丫

一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

二、DNA凝胶电泳、检测原理细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

三、酶联免疫吸附法核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物,测光吸收制。用途该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

四、流式细胞仪定量分析检测原理细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。应用价值流式细胞仪检测具有以下特点:1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶而呈强的红色荧光。

■DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶相反应与凋亡细胞裂解后3・的羟基端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种:1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3・-OH端2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3・-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。

■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

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