常规片段的琼脂糖凝胶回收,琼脂糖凝胶回收

日期:2020-02-08编辑作者:生命科学

核心提示:从琼脂糖凝胶中回收DNA,是一种简单不过的常规实验操作。但是由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验――比如酶切连接

核心提示:常规片断级的选择指南:所谓常规级,即回收片段大小介于100bp和10kb之间,在这个范畴内包含了一般的质粒或者克隆片段的回收。主

从琼脂糖凝胶中回收DNA,是一种简单不过的常规实验操作。但是由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验――比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等等,所以这一步的操作也显得非常重要。

常规片断级的选择指南:所谓常规级,即回收片段大小介于100bp和10kb之间,在这个范畴内包含了一般的质粒或者克隆片段的回收。主流方法是柱回收试剂盒。

胶回收的关键参数

Qiaquick Gel Extraction Kit

胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收,无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂,最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度),回收效率,操作方便,柱子的载量等等。

品牌:Qiagen回收范围:70bp-10kb价格:(50包装1,350,250包装6,372,约27元/反应,现有半价活动,价格非常可亲!)特点:

回收产物质量:回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中,普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖,会连同DNA一起从凝胶中抽提出来,会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断,产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收,质量还包括了产物的完整与否,如果机械剪切力使得回收产物大小不一致,后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收,质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小,对后继实验同样也有影响,比如连接、标记实验等等就很不爽,往往不得不再浓缩一次,增加了操作的复杂性。此外,极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。

  • 高达80%回收率

  • 操作快速简单,3步完成70bp-10kb片段的回收

  • 提供三色指示剂的电泳上样loading Buffer,方便判断和操作

  • 回收产物纯度高,可用于同位素或荧光测序、芯片分析、连接转化、酶切、标记、PCR、显微注射、体外转录等后继实验

回收率:回收得率,是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少,电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失,因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断,提高产物得率,对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关,比如DNA片断越大,和固相基质的结合力越强,就越难洗脱,回收率就低;又比如说,DNA的量越少,相对损失越大,回收率越低。因此,根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是,由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。

使用心得:

其他:操作方面,相信大家都会比较喜欢操作简单,快速,应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂,可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量,就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了,因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质,过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物,大载量就很有优势――同一个片断你要用2个柱子,不进浪费金钱,浪费时间,更让人郁闷。

Qiaquick最引以为傲的就是非常稳定的质量,高回收率和方便的步骤。产品质量的稳定可靠,一向是实验首要条件。毕竟,实验步骤是环环相扣的,每一步出现问题都会导致后患无穷,费时费力,还更费钱,对心情更是一种折磨。用试剂盒不就图省事和可靠吗?从核酸纯化领域起步的Qiagen,在全球实验室都享有极好的口碑,是值得信赖的选择。因为Qiagen有强大的研发队伍,精益求精优化实验操作的每一环节,绝非普通临摹制品、仿制品可比。以回收率为例,我们前面提到,由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。所以Qiagen以严谨的态度提供多种条件下的详细介绍:

使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA片段 。对所有尺寸的片段均获得了接近80%的回收率。A 1�C5: 回收之前; P: 回收之后再混合。样品使用 1.5% 琼脂糖凝胶分析。B 1�C3: 回收之前; P: 回收之后混合。样品于 3.5% 高分辨琼脂糖凝胶上分析。M: pTZ-HinfI marker。

记得《分子克隆II》里曾经说少于500ng的DNA几乎没有回收价值,看看上表就可以发现,现在的技术发展,即使是少到100ng的DNA还有70%的回收率呢!而且操作方法还很简单。

虽然是几乎不需要实验技巧的简单操作,如果你注意到一些小技巧 还是很有帮助的。DNA回收纯度取决于纯化介质对DNA吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而DNA回收率和浓度则与elution buffer的体积,以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率,充分洗脱,但是会造成产物浓度太低不好用。比如100-200ul的洗脱液可以彻底洗脱纯化柱吸附的DNA,不过考虑到后继实验的方便,Qiaquick建议使用50ul的洗涤液,正对加入膜中央(避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质),可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液,但是可能会降低回收率。有人试过用15―25ul洗脱2次,觉得这样第一次浓度高第二次比较充分,其实没有必要,只要适当延长在柱上停留的时间,就有助于提高得率――Qiagen的Protocol说明,30ul停留1分钟要比50ul停留1分钟回收浓度高1.7倍。充分离心有助于提高得率和纯度,减少残留对后继实验的影响(这个方法要注意不是所有试剂盒都可以使用,因为有些试剂盒的纯化柱填料松一些,离心有时可能导致少量填料脱落,而Qiagen的这个产品是膜式的,结合非常牢固,中大有人用这个柱子高温消毒后重复使用,效果不赖,可见皮实。当然这是厂家绝对不推荐的)。

其他的技巧也是大家熟知的,比如切胶的时候要尽量减少切胶体积,由于Qiaquick柱子的载量达到10ug,如果胶块实在太大而预期DNA总量不超过10ug,可以用大一点的管溶解,分几次上柱离心吸附后再洗涤。注意的是紫外照射时间不要太长,因为紫外线对DNA(特别是对于较大的片段)有影响。还有就是溶胶要彻底,用枪头把胶块弄碎一点有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值,如果变色需要调pH值以防止实验失败。需要用ddH2O或者TE洗脱的,注意pH在7.0―8.5之间的回收率最高。回收率和片断大小、多少有关,较大的片断回收率会有所降低,洗脱液预热到50度再加入纯化柱膜中央,有助于提高产率。

除了比较适合个人使用的传统离心式,Qiagen还提供抽滤式的胶回收试剂盒,用抽滤的方法替代离心,使得实验可以连续进行,特别适合批量进行的需要――想象看,你只要将溶胶液加入装配好的抽滤管中,哗一下就抽干了,再加洗涤的试剂,哗一下又好了,多快呀!节约很多时间和功夫,不需要在离心机前面拿进拿出。以后的全自动操作模式就是这样的啦!

看到这里可能大家都会说Qiagen的东西好是好,但是就是贵,一般的实验室都舍不得平时用,往往留着关键时刻做,不错,好东西自然不便宜,不过他们有时候也会打折促销。

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